Automatización del desarrollo de líneas celulares
Tipo de contenido: Nota de aplicaciónResumen
- El desarrollo de líneas celulares es un proceso multifacético que se extiende durante meses.
- La automatización con una estación de trabajo Biomek i7 ha ayudado a superar muchos de los desafíos que implica este flujo de trabajo, como:
- Contaminación de muestras
- Pipeteo constante de medios semisólidos
- Colocación en placa de células monoclonales limitando la dilución
- Selección de coincidencias para análisis de IgG y expansión celular
- La integración de dispositivos puede permitir:
- Reducción del tiempo de manipulación del material de laboratorio
- Recuento de células para cálculos durante el proceso de los volúmenes de transferencia
- Centrifugación de placas celulares para determinación inmediata de la monoclonalidad
- Mediciones automatizadas de confluencia y titulación para impulsar la selección de coincidencias
- Integridad de los datos y de las muestras en varios analizadores durante meses
Introducción
El desarrollo de líneas celulares es el proceso mediante el cual la maquinaria celular se acapara y utiliza para fabricar productos biológicos terapéuticos u otras proteínas de interés. Esto suele implicar la producción de anticuerpos en células de ovario de hámster chino (CHO) cultivadas en cultivos en suspensión para un uso eventual en biorreactores en la etapa de fabricación. El desarrollo de estas líneas celulares es un proceso largo y arduo con numerosos pasos y desafíos (Figura 1).
Figura 1. Proceso del desarrollo de líneas celulares Los pasos automatizados que se describen aquí aparecen indicados en rojo.
Una vez que las células CHO se han transfectado con la estructura de interés, es necesario un paso de selección para enriquecer las células que hayan aceptado la estructura. A continuación, las células individuales deben aislarse, cultivarse en colonias y ensayarse para la producción de proteínas. Una vez que se ha logrado esta pantalla de producción, los candidatos principales se expanden y mantienen para comprobar la estabilidad de la expresión. Finalmente, los mejores candidatos se optimizan aún más en diferentes condiciones de medios para mejorar la expresión u otros atributos de proteínas (por ejemplo, glucosilación) antes de escalar hasta niveles de producción.
Dado que este proceso lleva meses para completarse, hay muchos más desafíos, más allá de un flujo de trabajo celular típico a corto plazo. En primer lugar, mantener la esterilidad es esencial durante las diversas manipulaciones y durante las semanas de crecimiento desde una sola célula. En segundo lugar, como ocurre con la mayoría de los cribados, el rendimiento necesario para identificar un puñado de clones óptimos requiere normalmente miles de pocillos. Esta capacidad de procesamiento se reduce después de la fase de selección de coincidencias, por lo que se deberían programar campañas solapadas para maximizar los recursos. Por último, cuando los clones se mueven por el sistema y se reformatean en placas de menor densidad durante la selección de coincidencias, se debe realizar un seguimiento de todos los datos registrados previamente conforme se establecen estas líneas celulares. Hemos superado estos desafíos automatizando el establecimiento y la detección de clones para el desarrollo de líneas celulares.
Sistema automatizado para el desarrollo de líneas celulares
Todas las manipulaciones de células y la preparación de muestras se realizaron en una estación de trabajo Biomek i7 con pipeteadores Span-8 y una cabeza de 96 canales de capacidad de 1200 μl (Figura 2). Durante todo el experimento se utilizaron una caja con filtro HEPA y puntas de pipeta estériles. El Biomek se integró con una incubadora Cytomat 2C (Thermo Fisher), una centrífuga de microplacas (Agilent) y un analizador de viabilidad celular Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Se realizaron imágenes de células en un sistema Cloneselect Imager (dispositivos moleculares) y cuantificación de proteínas en un Octet HTX (Pall ForteBio) sin conexión, pero ambos dispositivos se pueden integrar con la estación de trabajo Biomek i7, ya sea directamente o con el uso de un transporte robótico.
Figura 2. Estación de trabajo Biomek i7 con varios dispositivos integrados.
Selección y enriquecimiento
El trabajo descrito aquí utilizó la línea DP12 de células CHO que expresaban moléculas de IgG contra la interleucina 8 (ATCC). En ausencia de agentes de selección, descubrimos que las células tenían una expresión variable que representaba correctamente el establecimiento de líneas de expresión estables.
Para enriquecer la población de células que secretan IgG antes de la expansión clonal, se dispensaron células CHO en un Vi-CELL XR integrado y 18 000 células a 22 ml de CloneMedia CHO Growth A, que contenían un medio de cultivo de CHO con una dilución 1:100 de reactivo CloneDetect (Molecular Devices). Utilizando un control de pipeteo fino, las células se resuspendieron lentamente en el medio y se dispensaron en placas de 6 pocillos sin introducir burbujas (A). Las placas se incubaron durante 12 días para formar colonias y luego se analizaron y recogieron utilizando el ClonePix 2 (Molecular Devices, Figura 3A)
En la Figura 3B se muestra una imagen de las placas de 6 pocillos tomada en los canales de campo claro y FITC con el ClonePix 2. Las colonias que excretaban IgG mostraron un halo de fluorescencia conforme las moléculas de IgG se agregaban cerca de la colonia dentro del medio semisólido y fueron teñidas por el reactivo CloneDetect. Basándose en características como el tamaño de las colonias, la forma y la intensidad de FITC externa, se recogió un subconjunto de colonias (Figura 3C) en placas de 96 pocillos con 200 μl de medio de cultivo de XP CHO Growth A para el cultivo, análisis y formación de colonias monoclonales adicionales.
Figura 3. Enriquecimiento de células secretoras. El ClonePix 2 (A) utiliza imágenes para identificar clones en medios semisólidos según el tamaño (crecimiento celular) y la fluorescencia externa (secreción de anticuerpos, B). C) A continuación, los clones óptimos se recogen de los medios semisólidos y se transfieren a placas de 96 pocillos para su cultivo en suspensión.
Aislamiento de células individuales y expansión
Para iniciar colonias de células únicas, se mezclaron y dispensaron células CHO en suspensión a un analizador de viabilidad celular Vi-CELL XR integrado para el recuento. A continuación, se tiñeron ~83 300 células con 0,25 μM de calceína AM a 37 °C durante 30 minutos. Tras una dilución inicial de 25 veces, se añadieron ~467 células a 140 ml de medio de cultivo XP CHO Growth A (Molecular Devices) de manera que había una célula por cada 300 μl de medio. Se logró una mezcla sólida y un llenado rápido de la placa gracias a la capacidad de aspirar y dispensar 96 ml de forma simultánea con la cabeza multicanal de 1200 μl. Las placas se centrifugaron en la centrífuga integrada de microplacas a 300 X g durante 3 minutos para garantizar que todas las células estaban en la parte inferior de la placa y para obtener imágenes inmediatamente en el generador de imagen CloneSelect (Figura 4A).
Después de la colocación en placa, se obtuvieron imágenes de los pocillos en canales de campo claro y fluorescentes para contar las células teñidas con calceína. Tal y como se esperaba con un enfoque de dilución limitada, aproximadamente el 33 % de los pocillos tenía una única célula en cinco experimentos (placa representativa mostrada en la Figura 4B). Se permitió que las células creciesen durante tres semanas y se evaluó la confluencia celular en varios puntos temporales. Al utilizar medios acondicionados (véase la sección Deliberación) logramos el crecimiento en aproximadamente el 50 % de los pocillos monoclonales, lo que resultó en que aproximadamente el 15 % de los pocillos emplacados fuesen aptos para el establecimiento de una línea celular permanente (Figura 4C, destacado en rosa).
Figura 4. Identificación de colonias derivadas de células individuales. Tras la colocación en placa de las células con dilución limitada, se utilizó el generador de imágenes CloneSelect (A) para contar las células teñidas con fluorescencia en cada pocillo y para identificar los pocillos monoclonales (B, pocillos verdes). (C) La confluencia celular también se midió durante tres semanas para identificar los pocillos monoclonales que crecieron hasta convertirse en colonias y justificaron las pruebas de expresión de IgG (destacado en rosa).
Producción de proteínas de ensayo
En un cribado típico, todos los pocillos se ensayarán en busca del indicador pertinente. Sin embargo, dado que solo el 15 % de los pocillos tienen potencial de avanzar, elegimos los medios de muestras solo de los pocillos con crecimiento de colonias desde una única célula. Utilizando los pipeteadores Span-8, se transfirió medio para replicar los pocillos de una placa de pocillos inclinada de 384 pocillos para análisis en los biosensores Octet HTX (Figura 5A) y se usaron biosensores recubiertos con proteína A para la cuantificación de IgG.
Para el análisis de IgG, se generaron curvas de unión con los patrones conocidos de proteína A (Figura 5B) y se compararon con las curvas de unión de los pocillos analizados (Figura 5C) para establecer la concentración de IgG (Figura 5D). Los pocillos con alta expresión se resuspendieron y transfirieron a placas de 24 pocillos de área mayor para un posterior análisis de expansión y procesamiento.
Figura 5. Cuantificación de IgG. El Octet HTX (A) se utilizó para medir curvas de unión de estándares conocidos (B) y pocillos con colonias derivadas de células individuales (C). Los estándares se utilizaron para cuantificar la IgG de los pocillos desconocidos y los clones más productivos (D, con un círculo) siguieron adelante en el proceso.
Sistema integrado de desarrollo de líneas celulares
Los dispositivos descritos aquí pueden integrarse en una única estación de trabajo que reduce la intervención humana y, por tanto, ahorra tiempo y reduce la oportunidad de errores (Figura 6). Además, los datos de los diversos analizadores pueden utilizarse directamente para impulsar los pasos posteriores (p. ej., la selección de coincidencias), sin necesidad de transferencias de datos manuales ni manipulación. El conjunto de software SAMI puede gestionar el procesamiento de múltiples placas a través del sistema integrado y realizar un seguimiento de dónde se encuentran las células dentro de una aplicación de varias semanas, como el desarrollo de líneas celulares. Además, el software DART actúa como repositorio de datos que almacena datos durante un proceso o entre procesos y garantiza que los datos sean fácilmente accesibles para análisis adicionales. Al integrar los dispositivos, tanto la integridad de la muestra como la de los datos se mejoran durante el largo flujo de trabajo entero.
Figura 6. Ejemplo de un sistema de desarrollo de líneas celulares integrado (frontal y posterior).
Deliberación
Aquí hemos descrito una solución automatizada que supera los desafíos más complejos del desarrollo de las líneas celulares. Pudimos mantener células en estado estéril a través de múltiples manipulaciones durante un periodo de tiempo de más de 5 semanas. La estación de trabajo Biomek i7 puede automatizar estas manipulaciones en el paso necesario para el desarrollo de líneas celulares y el generador de imágenes CloneSelect y Octet HTX son capaces de seguir el ritmo de este rendimiento para las evaluaciones clonales. La integración de estos dispositivos reduce aún más el esfuerzo necesario para ejecutar este flujo de trabajo y mejora la trazabilidad de los datos eliminando las oportunidades de errores al manipular material de laboratorio o archivos de datos.
A pesar de estos logros, aún era necesario superar todavía más desafíos biológicos. En primer lugar, mientras que el paso de limitación de la dilución se automatizó correctamente, inicialmente descubrimos una mala supervivencia y mal crecimiento de las células. Al acondicionar primero los medios de cultivo con 1X105 células CHO/ml durante dos días, pudimos lograr la supervivencia del 50 % descrita anteriormente, lo que indica que el mal crecimiento se debe a los desafíos del cultivo monoclonal en lugar de a una mala colocación en placas automatizada. La supervivencia celular también se vio influida negativamente por las concentraciones más altas de calceína. Probablemente, el bajo nivel de calceína contribuyó a un periodo relativamente corto en el que la tinción fue visible en las imágenes, aunque también es probable que dependa de la línea celular de CHO específica. Este tiempo de detección de ~2 horas podría limitar potencialmente el rendimiento de la placa según el tiempo de lectura del generador de imagen (~15 min/placa en el generador de imágenes Cloneselect), sin embargo, los tiempos escalonados de adición de tinción y placas podrían incluirse en los métodos automatizados para superar este límite.
En el momento del cribado de colonias pueden observarse factores adicionales que pueden generar confusión. Aunque la confluencia de las células en la imagen es suficiente para determinar si las células han crecido, la localización de la célula iniciadora dentro del pocillo (p. ej., en el centro o en el borde) puede afectar a la forma de la colonia, de manera que no existe una correlación directa entre la confluencia y el número de células. Aunque sería deseable determinar el rendimiento de IgG por célula, esto es mejor para una etapa posterior durante la expansión celular, cuando se pueda lograr un recuento celular más preciso. Otro desafío con la cuantificación de IgG es la posibilidad de evaporación durante las tres semanas de cultivo. El material de laboratorio especializado con pocillos de evaporación puede ayudar con esto, pero para facilitar su uso, hemos añadido 300 μl/pocillo de medio para reducir el impacto de la evaporación en comparación con los volúmenes de pocillos inferiores. Al igual que con los recuentos celulares, la producción de IgG puede determinarse con mayor exactitud durante la expansión de las células y durante la prueba de estabilidad genómica.
Aunque los pasos del flujo de trabajo de desarrollo de líneas celulares son bastante universales, existen muchas formas diferentes de realizar estos pasos. La impresión de células individuales o la clasificación de células se podrían utilizar como medios más eficientes para establecer pocillos monoclonales. Los ensayos ELISA u otros métodos podrían utilizarse para la producción de anticuerpos de titulación, ya que el sistema automatizado podría utilizarse para programar el procesamiento eficaz de la producción necesaria en cuanto a preparación de muestras.
Incluso el orden de los pasos que describimos aquí se puede alterar. Utilizamos imágenes para identificar los pocillos que crecieron a partir de una sola célula, de manera que los biosensores Octet pudiesen conservarse, analizando únicamente los pocillos relevantes. Si uno carece de la capacidad de obtención de imágenes fluorescentes para la determinación de la monoclonalidad, podría obtener una imagen de todos los pocillos en campo claro en el momento de la siembra y ensayar todos los pocillos para la producción de proteínas. Solo se comprobarían visualmente los pocillos con expresión alta en busca de una única célula en las imágenes iniciales.
Por último, los pasos adicionales del flujo de trabajo de desarrollo de líneas celulares más allá de las descritas aquí también pueden beneficiarse de la automatización. Hemos automatizado las tareas básicas del cultivo celular y podemos aliviar la carga del paso repetido necesario para determinar la estabilidad clonal (mantenimiento de células uniforme y colocación en placas a través de Automation SAE-2585APP04.17. Además, hemos automatizado un diseño de enfoque para el experimento que optimiza los componentes de medio para mejorar la producción de proteínas (optimización automatizada de la producción de IgG en células CHO SAE-2148APP11.16). Más información sobre la automatización del enriquecimiento, la limitación de la dilución y los pasos de selección de coincidencias, así como también la manipulación de datos están disponibles también (Gestión de datos de desarrollo de líneas celulares SAE-3996APP08.18, Selección de coincidencias de desarrollo de líneas celulares SAE-3998APP08.18, Limitación de la dilución en el desarrollo de líneas celulares SAE-3999APP08.18, Selección y enriquecimiento en el desarrollo de líneas celulares SAE-4000APP08.18). Al automatizar la mayor parte del proceso de desarrollo de líneas celulares, el esfuerzo de cada campaña se minimizará mientras la integridad de la muestra y los datos se maximizará.
Las estaciones de trabajo automatizadas Biomek no están destinadas ni se han validado para su uso en el diagnóstico de enfermedades u otras afecciones. Los kits de reactivos genómicos de Beckman Coulter Life Sciences son solo para uso en investigación.