Consideraciones del análisis de recuento celular al utilizar distintos tipos de células

Beckman Coulter Life Sciences se enorgullece de presentar nuestro nuevo Analizador de viabilidad celular Vi-CELL BLU. Vi-CELL BLU aprovecha las características clave de rendimiento del VI-CELL XR pero incorpora muchas mejoras de diseño que nuestros clientes han solicitado a lo largo de los años.

Aunque se trata de una aplicación aparentemente sencilla, el recuento automatizado de células puede verse influido por una variedad de condiciones y variables que surgen tanto de la muestra como del instrumento. Con el nuevo Vi-CELL BLU hemos introducido la capacidad de cargar 96 muestras en una placa estándar y ejecutarlo como un solo experimento. Sin embargo, se requieren aproximadamente 3 horas para que toda la placa se ejecute, lo que podría no ser ideal, especialmente para tipos celulares que generalmente tienen baja viabilidad o que tienen tendencia a sufrir deterioro cuando se encuentran fuera de la incubadora o del biorreactor.

El cargador de placas también nos permite evaluar múltiples condiciones experimentales diferentes en un solo ciclo, proporcionando así la oportunidad de evaluar una variedad de condiciones o criterios.

Para demostrar estas capacidades, hemos revisado varios tipos de células y enfoques de preparación celular diferentes utilizando células estándar.Imagen de carga lateral de VI CELL BLU

Recuento celular y análisis

Cultivos celulares de CHO (ovario de hámster chino), EL4 (línea celular de linfocitos T de ratón), células de insectos SF9 (tejido ovárico de Spodoptera frugiperda) se utilizaron y células HELA para evaluar los efectos de duraciones prolongadas de análisis y diferentes condiciones de preparación de muestras en diferentes tipos de células.

Impacto de la preparación de muestras de células CHO

La centrifugación y la resuspensión son métodos rutinarios para lavar y concentrar células antes de la reactivación o uso en otros experimentos. Las células CHO suelen considerarse bastante duraderas, pero tienen requisitos de crecimiento muy específicos y requieren medios especializados para lograr la mejor salud. En el experimento siguiente las células se centrifugaron a 1000G durante 5 minutos, una centrifugación relativamente leve antes de ser resuspendida en el medio o tampón para evaluar el impacto, si es que existiese, de la preparación celular sobre la salud celular

Resultados 

Tratamiento Concentración (M/ml) Viabilidad (%) Diámetro (µm)
Sin tratar 4,83 94,30 16,12
1 centrifugación de resuspensión en medio 5,05 94,48 16,17
1 centrifugación con resuspensión en PBS 4,70 65,69 14.17
2 centrifugaciones resuspendidas en PBS 4,45 53,77 13,99

Los resultados muestran que la centrifugación y la resuspensión en los medios recomendados no tienen un impacto apreciable en las células CHO. Sin embargo, la resuspensión en tampón de PBS provoca una pérdida drástica de viabilidad y una reducción significativa del diámetro de la célula media. También hay una reducción leve de la concentración celular, que puede esperarse de las pérdidas durante la resuspensión. La centrifugación y resuspensión por segunda vez en PBS tiene un impacto negativo adicional en la viabilidad celular y el impacto en el tamaño de las células

del método de preparación de muestras en la concentración de células de CHO vi-cell bluimpacto del método de preparación de muestras sobre viabilidad y diámetro de CHO

Figura 2.
Impacto del método de preparación de muestras en células CHO

Análisis del ciclo de mezcla de las células EL4

Las células EL4 se consideran generalmente frágiles e incluso en condiciones ideales crecen lentamente y muestran una viabilidad inferior al 70 %. Se prepararon células EL4 y se dispensaron en una placa de 96 pocillos. Los perfiles de tipo de célula se crearon utilizando el perfil de célula de mamíferos estándar como origen y diferentes niveles de ciclos de mezcla. El objetivo era evaluar el impacto, si existiese, de una agitación aumentada en un tipo de célula que se sabe que se daña fácilmente mediante la mezcla y centrifugación por vórtice

Resultados

Los resultados de las células EL4 se indican a continuación:

Ciclos de mezclado Recuento celular Recuento de células viables Concentración (M/ml) Viabilidad (%) Diámetro (µm)
1 4648 2837 1,72 61,06 11,34
3 4637 2715 1,72 58,54 11,34
5 4660 2582 1,73 55,69 11,34
7 4660 2448 1,73 52,53 11,32


Aunque los recuentos de células, concentración y valores de diámetro no demuestran ser estadísticamente significativos, existe una disminución marcada del recuento de células viables y, por consiguiente, en la viabilidad celular con ciclos de mezcla aumentados en todas las diluciones. Esto puede indicar que un perfil de tipo de célula con ciclos de aspiración y mezcla reducidos puede ser más adecuado para este tipo de célula y que la agitación excesiva puede no ser ideal y debe evitarse

impacto de los ciclos de mezcla en la viabilidad celular EL4

Figura 3. Impacto de los ciclos de mezcla en las células EL4

Células de insectos SF9

Incluso cuando se cultivan en condiciones ideales, las células SF9 no alcanzan de forma sencilla altas densidades y suelen tener viabilidad por debajo del 60 %. Por lo tanto, es posible que el tiempo prolongado de instrumento necesario para una ejecución de placa pueda afectar negativamente al cultivo celular. Para evaluar estas células SF9, se han colocado en placas y ejecutado utilizando el perfil estándar para células de insecto.

Los resultados muestran que a lo largo de la ejecución de 3 horas no hubo ningún impacto detectable en la viabilidad celular ni ningún cambio notable en el diámetro de las células que pudiera producirse si las células murieran o se hincharan. Como tal, parece que esta línea celular, aunque baja en viabilidad, es lo suficientemente robusta como para pasar periodos prolongados fuera del entorno de la incubadora de células sin efectos adversos

viabilidad celular y diámetro medio de las células SF9 a lo largo del tiempo

Figura 4. Viabilidad y diámetro medio de las células SF9 a lo largo del tiempo. No se observó ningún cambio significativo durante el transcurso del experimento. 

Cultivos celulares HELA

Las células HELA se cultivaron hasta un alto estado de confluencia para estresar las células. A continuación, las células se recogieron y se dispersaron en suspensión. A continuación, las células se colocaron en una placa de 96 pocillos y se recogieron datos utilizando el perfil de células de mamíferos estándar. La placa se ejecutó y se recogieron datos por columnas para garantizar el mismo intervalo de tiempo entre las muestras en las filas.

Se observó que las muestras más recientes en la serie de placas informaban de concentraciones ligeramente superiores. Otras investigaciones mostraron que las células estaban aumentando en cuanto a diámetro medio a medida que avanzaba el tiempo.

aumento porcentual de diámetro medio a lo largo del tiempo para las células HELA

Figura 5. Aumento porcentual del diámetro porcentual de las células HELA a lo largo del tiempo

La visualización de las imágenes adquiridas muestra un número creciente de células que parecen hincharse o crecer junto con un gran número de vesículas no celulares. Aunque esto último no suele afectar al recuento celular, dependiendo de la configuración de perfil celular, se pueden contar como células pequeñas. El efecto de hinchazón provoca que el diámetro de la célula media aumente casi un 10 % durante las 3 horas que se tarda en ejecutar la placa y puede provocar que algunas células más pequeñas por debajo del umbral de diámetro inferior se incluyan en los recuentos de células.

hinchazón y crecimiento en células HELA después de > 2 horas fuera de la incubadora

Figura 6. Hinchazón y crecimiento en células HELA después de > 2 horas fuera de la incubadora

Conclusiones

Se recomienda que antes de realizar un cultivo celular en una placa completa se realice una evaluación inicial para determinar la solidez de las células implicadas y su capacidad para tolerar los métodos de preparación de las muestras y una exposición prolongada fuera del entorno de la incubadora. Incluso las células de ingeniería, como las células CHO o las células HELA inmortales, que generalmente se seleccionan por ser bastante duraderas, pueden afectar a las condiciones de estrés o de preparación de muestras específicas.






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