Recuento de células del analizador de viabilidad celular Vi–Cell BLU

Beckman Coulter Life Sciences se enorgullece de presentar nuestro nuevo analizador de viabilidad celular Vi-Cell BLU. El Vi–Cell BLU aprovecha las características clave del Vi-Cell XR pero incorpora muchas mejoras de diseño que nuestros clientes han solicitado a lo largo de los años. Si bien se trata de una aplicación aparentemente sencilla, el recuento automatizado de células puede verse influido por una variedad de condiciones y variables que surgen tanto de la muestra como del instrumento. Por tanto, es importante asegurarse de que el instrumento está funcionando dentro de las especificaciones de manera que pueda eliminarse cualquier variabilidad del instrumento en las mediciones de las muestras. Para determinar el rendimiento de recuento celular del Vi–CELL BLU, hemos adaptado el protocolo de medición de células con NIST (Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a dilution series experimental design. Sarkar, Sumona et al. (2017) Cytotherapy, Volume 19, Issue 12 1509 – 1521). Al utilizar una serie de diluciones, se puede evaluar el rendimiento del instrumento determinando el recuento de células proporcionales en las diluciones y replicando muestras. Además de utilizar células, también evaluamos el sistema utilizando microesferas estandarizadas que se pueden utilizar para la calibración de concentración, viabilidad y tamaño y como muestras independientes de células para evaluar el rendimiento del instrumento.

Comparaciones de los datos de recuento de micropartículas y células

Materiales de muestra utilizados

6602796 (lote 9747455F) Coulter CC L10 estándar, 10 μm, partículas de látex (conforme con las directrices del NIST), 1 x 15 mL

Perfil de tipo de célula: Gránulos BCI L10

 Configuración del instrumento para análisis de micropartículas

Perfil de tipo de célula	Gránulos BCI L10
Diámetro mínimo (µm)	5
Diámetro máximo (µm)	15
Imágenes	100
Nitidez celular	22
Circularidad mínima	0,5
Grado de desagrupación	Medio
Ciclos de aspiración	3
Brillo del punto viable (%)	50
Área del punto viable (%)	1
Ciclos de mezclado	3

Datos registrados como promedios de 72 muestras para cada dilución de 3 placas de 96 pocillos de replicación. Resultados de esferas de control. Tipo de muestra: Control de esferas de tamaño L10 (3 instrumentos con placas replicadas)

Resultados de las esferas de control

Tipo de muestra: Control de esferas de tamaño L10 (3 instrumentos con placas replicadas)

Recuento celular y análisis

El rendimiento del instrumento para el recuento celular se determinó utilizando células CHO cultivadas estándar. Las células se prepararon siguiendo las pautas de dilución descritas por NIST ilustradas a continuación y los datos analizados utilizando el tipo de célula de mamíferos estándar. Los parámetros de tipo de célula para los protocolos se proporcionan a continuación.

Ajustes del instrumento para el análisis de cultivo celular:

Tipo de célula	Mamífero
Diámetro mínimo (µm)	6
Diámetro máximo (µm)	30
Imágenes	100
Nitidez celular	7
Circularidad mínima	0,1
Grado de desagrupación	Medio
Ciclos de aspiración	3
Brillo del punto viable (%)	55
Área del punto viable (%)	5
Ciclos de mezclado	3

 

Resultados del recuento de células

Se estableció un protocolo de dilución de 8 diluciones en serie de células CHO para analizar el rendimiento de recuento celular en diferentes intervalos de concentración. Las concentraciones de intervalo inferior fueron 9 placas replicadas que se procesaron en 3 instrumentos Vi–CELL BLU (3 placas por instrumento). Se procesaron intervalos de concentración más altos como 3 conjuntos de muestras replicadas de 10 tubos por dilución utilizando el carrusel debido a la disponibilidad limitada de muestras

Dilución	Concentración nominal (x10^6) células/ml	Concentración nominal (x10^6) células/ml
	Intervalo bajo de medio alcance	Intervalo medio-alto
100 %	5,50	13
80 %	4,40	10 M
60 %	3,30	8 M
50 %	2,75	6,5 M
40 %	2,20	5,2 M
30 %	1,62	3,9 M
20 %	1,10	2,6 M
10 %	0,55	-

 

Resultados

Figura anterior: Datos de la serie de dilución de intervalo de concentración baja de células CHO

Figura anterior: Datos de intervalo de concentración alta de células CHO

 

Se procesaron placas de muestras adicionales utilizando un intervalo más pequeño de diluciones para confirmar el rendimiento de los instrumentos. Se repitieron 3 veces en un periodo de 16 horas utilizando el mismo suministro de existencias de células, ejecutado en el mismo instrumento. Durante este periodo, el aumento de la población celular se considera mínimo y el material fuente para análisis es de eficacia similar.

Se procesaron 3 placas por triplicado en 3 instrumentos de Vi–CELL BLU diferentes (9 placas en total, n = 864 muestras). Los datos siguientes muestran el promedio de 216 muestras por cada dilución. Los datos recogidos de estas series se someten a un análisis ANOVA para determinar el grado de variabilidad entre los ciclos y dentro de cada ciclo a lo largo de las repeticiones de muestras. Los resultados no resultaron significativos estadísticamente (valor de p > 90) entre todas las series, en todos los instrumentos.

Dilución	Concentración nominal (x10^6) células/ml
100 %	2
50 %	1
15 %	0,5
10 %	0,2

Figura anterior: Serie de diluciones de células CHO, múltiples réplicas

 

Conclusiones

El rendimiento de recuento del Vi-CELL BLU muestra una linealidad excelente en varias diluciones que cubren un intervalo de 0,5 y 15 millones de células por ml. Como se esperaba, los recuentos de células por debajo de 0,5 millones de células por ml muestran una variabilidad superior debido a un número bajo total de células por fotograma de imagen. Aun así, la variabilidad permanece dentro de los límites permitidos (10 %) para el rendimiento del instrumento. Al utilizar esferas de tamaño L10 estándar, la variabilidad en los recuentos es significativamente menor debido a la naturaleza más uniforme del material de la muestra. Utilizando el protocolo NIST recomendado, la dilución proporcional actúa como un control interno para el recuento celular, garantizando que el instrumento cuente con exactitud en diferentes intervalos de concentración celular. La correlación de los recuentos y la concentración entre las diluciones tiene un valor R2 de >0,99, lo que muestra un rendimiento de recuento consistente en las diluciones. Debe tenerse en cuenta que el gran número de muestras que es posible ejecutar en el Vi-CELL BLU también permite aumentar la confianza en los recuentos de células y facilitar la identificación de resultados anómalos.

 

   

 

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