Analytical Ultracentrifugation Overview

Ultracentrifugado analítico (UCA) para caracterización de macromoléculas en solución

El ultracentrifugado analítico (UCA) es la tecnología más versátil, rigurosa y precisa disponible para determinar el peso molecular y las propiedades hidrodinámicas y termodinámicas de una proteína u otra macromolécula. 

Aunque su historia se remonta casi a un siglo, el UCA es:

  • Una técnica autónoma, de principios básicos, que se realiza en un entorno sin constricciones y no requiere estándares.
  • No igualada por otras técnicas en el aporte del mismo tipo de información con un nivel comparable de precisión y exactitud. 
  • El método de referencia para la determinación del peso molecular de proteínas en solución.2

Introducción al UCA: observaciones basadas en la velocidad y el equilibrio

A diferencia de otros métodos utilizados para analizar macromoléculas, el ultracentrifugado analítico (UCA) permite la caracterización de muestras en estado nativo en condiciones de solución con relevancia biológica. El UCA puede usarse para investigar prácticamente cualquier tipo de molécula o partícula en un amplio intervalo de concentraciones y en una gran variedad de disolventes. En muchos campos de investigación no existe un sustituto analítico al UCA que sea satisfactorio.1

El UCA aporta a los investigadores dos visiones complementarias del comportamiento de las soluciones. La velocidad de sedimentación proporciona información hidrodinámica de principios básicos sobre el tamaño y la forma de las moléculas. El equilibrio de sedimentación proporciona el mismo tipo de información sobre la masa molar de las soluciones, estequiometrías, constantes de asociación y no idealidad de las soluciones.

¿Más preguntas? Más respuestas.

En un experimento, la tecnología UCA puede aportar más respuestas a cuestiones críticas que cualquier otra técnica comparable:

  • Forma:¿Cuál es la esfericidad de mi proteína?
  • Diámetro: ¿Cuál es el tamaño de mi partícula?
  • Masa: ¿Cuál es el peso molecular de mi proteína o complejo en solución?
  • Estequiometría: ¿Cuántas subunidades forman mi proteína?
  • Pureza: ¿Hay otras partículas en mi muestra?
  • Formulación: ¿Cómo se comporta mi proteína en este tampón?
  • Heterogeneidad: ¿Está mi proteína unida a otras moléculas? ¿Cuál es la configuración del complejo?
  • Agregación:¿Está mi proteína todavía en forma utilizable? ¿Debo esperar una respuesta inmunitaria a la formulación de mi fármaco?
  • Asociación: ¿Se asocia o se disocia mi proteína con otras proteínas?
  • Conformación:  ¿Cambia la conformación de mi proteína al unirse a un ligando?

Sepa más cosas sobre el UCA con nuestro manual Introducción al ultracentrifugado analítico.

Referencias

1 Cole JL, Lary JW, Moody T, et al. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Methods Cell Biol 2008;84:143–79.

2 Berkowitz S, Philo J. Characterizing Biopharmaceuticals using Analytical Ultracentrifugation. In: Houde D, Berkowitz S, editors. Biophysical Characterization of Proteins in Developing Biopharmaceuticals. Amsterdam: Elsevier; 2015. p. 211-260.

 

 

Content and Resources

A Guide to Winning a Shared Instrumentation Grant (SIG) The Shared Instrumentation Grant (SIG) Program provides funds for purchasing shared-use instrumentation not typically supported by other funding programs sponsored by the National Institutes of Health (NIH).
Physical and Chemical Characterization of Nanoparticle Constructs Using the Analytical Ultracentrifuge Webinar covers physical and chemical characterization of nanoparticle constructs using analytical ultracentrifugation. Webinar is presented by Osman M Bakr from King Abdullah University of Science and Technology. 
Analysis of Particle Size Distributions by Analytical Ultracentrifugation Helmut Cölfen discusses and particle size distributions by analytical ultracentrifugation.
Analytical Ultracentrifugation in the Biopharmaceutical Industry Dr. Alexander Bepperling focuses on the data analysis tools to achieve high precision when analyzing biopharmaceutical products due to an interest in minor species of about 1-2% usually comprising of the total protein content. He focuses on the data analysis done in SEDFIT. Learn how to set up continuous c(S) distribution analysis as implemented with SEDFIT software for enhanced reproducibility during a study of many batches of one protein. Also covers applications of sedimentation equilibrium (SE) for screening weak interactions and determining detergent binding to proteins.

What is an analytical ultracentrifuge?

Optima AUCAn analytical ultracentrifuge is similar to a high-speed preparative centrifuge, except that the particles in the sample being spun are monitored in real time by an integrated optical detection system. These optical systems (UV-Vis absorbance and Rayleigh interference) enable precise observation of the solution behavior of molecules as they undergo sedimentation. Using state-of-the-art software, data can be used for a comprehensive analysis of molecules in the sample being studied.